EMBO J︱神经元Miro1蛋白缺失破坏线粒体自噬并过度激活整合应激反应

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撰文︱唐家辉

责编︱王思珍

线粒体（mitochondria）是ATP的主要来源，负责维持Ca²⁺稳态，同时是脂质合成的场所。然而，损伤或衰老等因素引起线粒体质量下降时，线粒体的“工作效率”变差，产生大量活性氧（ROS），导致细胞损伤。因此，严格控制线粒体质量对细胞的正常功能是至关重要的。线粒体质量控制则高度依赖线粒体自噬机制，清除受损的线粒体组分【1】。

PINK1（PTEN-induced putative kinase 1）是一种线粒体丝/苏氨酸激酶，Parkin是一种E3泛素连接酶。PINK1与Parkin共同作用，通过线粒体自噬（mitophagy）促进受损线粒体的选择性清除。当线粒体损伤时，PINK1不断在线粒体外膜上累积，募集Parkin到线粒体外膜，继而泛素化底物，招募自噬接头分子，从而通过自噬途径清除此部分受损的线粒体【2-4】。PINK1和Parkin的功能缺陷与罕见的隐性帕金森病（Parkinson’s disease，PD）相关【5】，提示线粒体自噬可影响神经元的存活并与神经退行性疾病的发病机制息息相关。

Miro（mitochondrial Rho）蛋白家族在哺乳动物中主要分为Miro1和Miro2，一直被认为是线粒体运输和分布的关键调节因子，也是线粒体-内质网偶联的关键组分，维持细胞内Ca²⁺稳态【6, 7】。线粒体损伤时，Miro蛋白被快速泛素化，并通过PINK1/Parkin依赖的自噬机制降解【8】。有学者认为，这种PINK1 /Parkin对Miro蛋白的运输调节机制可能有助于将受损的线粒体与微管蛋白和肌动蛋白分离，促进受损细胞器与正常功能细胞器的分离【6】。

近期研究发现，Miro蛋白可以直接作为线粒体外膜（outer mitochondrial membrane，OMM）上的Parkin的受体，以促进Parkin募集介导线粒体自噬【9】。此外，在PD患者来源的成纤维细胞中发现Miro降解受阻，且多个Miro1突变已被确定为PD的危险因素，这进一步支持了Miro1参与PD的发病机制【10】。尽管，有越来越多的研究指出Miro蛋白在调节线粒体自噬中的新作用，并且Miro1与PD病理之间的联系日益密切，但Miro1如何破坏线粒体和神经元稳态、及其长期后果，仍知之甚少。

近期，在以Loss of neuronal Miro1 disrupts mitophagy and induces hyperactivation of the integrated stress response为题发表在The EMBO Journal上的研究论文中，英国伦敦大学学院的Josef T Kittler实验室揭示了线粒体损伤后Miro1的泛素化及降解对于Parkin募集到线粒体外膜及线粒体自噬是必要的，体内条件性敲除Miro1可导致神经元线粒体过度融合并持续激活整合应激反应（ISR）。因此，研究为 Miro1在调节PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬及其失调对神经系统疾病的影响提供了新见解。

首先，作者们在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中发现基因Miro1和Miro2双重敲除可以延缓受损线粒体自噬过程中Parkin被募集到受损线粒体OMM的过程（图1）；重新回补Miro1（非补回Miro2）后可恢复细胞正常线粒体自噬水平，即OMM上Miro的存在对于Parkin被有效招募到受损线粒体和线粒体自噬是至关重要的。同时，作者也发现，Miro1蛋白泛素化水平的降低可能会影响受损线粒体的周转速率；Miro的泛素化和降解可能不仅是停止受损线粒体运输所必需的，而且可能直接参与线粒体吞噬过程。换言之，Miro1的泛素化和降解对于通过线粒体自噬从而清除受损线粒体是必需的。

图1 线粒体自噬过程中Parkin募集至线粒体外膜（A），Miro1/2双重敲除延缓线粒体自噬过程（B）。

（图片引自：López-Doménech G, et al., EMBO J 2021; 40: e100715）

在小鼠原代皮层神经元中Miro1敲除也可阻断缬氨霉素（valinomycin）介导的线粒体自噬及重塑（图2）。而在重新回补不同形式的Miro1（野生型、赖氨酸突变型等）的实验中发现，在原代神经元线粒体受损和受损线粒体自噬（清除）过程中，Miro1以依赖于其泛素化的方式募集并稳定Parkin于线粒体膜上。

图2 Miro1敲除抑制缬氨霉素诱导的神经元线粒体自噬。

（图片引自：López-Doménech G, et al., EMBO J 2021; 40: e100715）

线粒体自噬缺陷可导致神经系统疾病的线粒体功能障碍的年龄依赖性积累。随后，作者们构建了海马及皮层神经元分别特异性敲除Miro1和Miro2的小鼠模型，发现12月龄Miro1敲除小鼠海马神经元中Parkin的底物，线粒体融合蛋白1和2（即MFN1、MFN2）的蛋白水平增加，泛素化水平降低。这表明小鼠大脑成熟神经元中Miro1缺失会引起受损线粒体随年纪增加而不断积累，同时会导致线粒体自噬机制的增加（图3）。

图3 神经元Miro1缺失上调MFN1/2水平（A、B），且升高的MFN1/2定位于线粒体（C、D）。

（图片引自：López-Doménech G, et al., EMBO J 2021; 40: e100715）

上述结果也暗示了Miro1敲除小鼠中Mfn1和Mfn2的显著上调原因，即可能是由于PINK1/ parkin介导的线粒体自噬机制被破坏而导致线粒体分裂/融合（fission/fusion）动态平衡改变，从而线粒体网络发生了病理性的重构。的确，实验发现，小鼠海马神经元中Miro1敲除会严重破坏线粒体的形态和超微结构，包括线粒体胞体重塑，以及线粒体肿胀、变圆、内部电子密度降低，这提示Miro缺失会破坏线粒体稳态；而且由于线粒体融合/分裂稳态失衡导致出现巨型线粒体（megamitochondria）。实验也发现，小鼠大脑内长时间的Miro1缺失也会引发整合应激反应（ISR）的过度激活，影响神经元的存活（图4）。通常而言，ISR是一种整体降低蛋白质合成率的保护性途径。 然而，这一途径的持续激活会导致重要蛋白翻译的缓慢减少，从而可能导致神经元死亡【11,12】。

图4 神经元Miro1缺失引起线粒体过度融合（A、B）并引发整合应激反应（C）。

（图片引自：López-Doménech G, et al., EMBO J 2021; 40: e100715）

图5 工作总结图: Miro1缺失导致线粒体稳态的长期破坏与线粒体融合、线粒体重塑和整合应激反应 （ISR）的持续激活有关。

（图片引自：López-Doménech G, et al., EMBO J 2021; 40: e100715）

文章结论与讨论，启发与展望

这项发现为Miro1和Miro2在线粒体损伤后线粒体自噬中的作用提供了新的见解，并强调了它们在体外和体内线粒体稳态中的重要性。该研究还发现了Miro1作为线粒体外模Parkin受体复合物的一部分作用，以及它在调节Parkin介导的线粒体质量控制方面的潜在作用。此外，在小鼠体内神经元中Miro1的长期缺失导致Mfn1/2上调、线粒体网络重构和ISR的诱导。因此，这项研究为神经退行性疾病（比如PD）以及其他相关疾病的发病机制中线粒体功能障碍的靶向治疗提供了新的策略。 

原文链接：https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.2018100715

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参考文献（上下滑动查看）  

【1】Pickles S, Vigie P, Youle RJ (2018) Mitophagy and Quality Control Mechanisms in Mitochondrial Maintenance. Current biology : CB 28: R170 – R185 

【2】Vives-Bauza C, Zhou C, Huang Y, Cui M, de Vries RLA, Kim J, May J, Tocilescu MA, Liu W, Ko HS et al (2010) PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proc Natl Acad Sci USA 107: 378 – 383 

【3】Sarraf SA, Raman M, Guarani-Pereira V, Sowa ME, Huttlin EL, Gygi SP, Harper JW (2013) Landscape of the PARKIN-dependent ubiquitylome in response to mitochondrial depolarization. Nature 496: 372 – 376 

【4】Lazarou M, Sliter DA, Kane LA, Sarraf SA, Wang C, Burman JL, Sideris DP, Fogel AI, Youle RJ (2015) The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature 524: 309 – 314 

【5】Thomas B, Beal MF (2007) Parkinson’s disease. Hum Mol Genet 16: R183 – R194 

【6】Lopez-Domenech, G., et al., Loss of Dendritic Complexity Precedes Neurodegeneration in a Mouse Model with Disrupted Mitochondrial Distribution in Mature Dendrites. Cell Rep, 2016. 17(2): p. 317-327.

【7】Modi, S., et al., Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 4399.

【8】Ordureau, A., et al., Dynamics of PARKIN-Dependent Mitochondrial Ubiquitylation in Induced Neurons and Model Systems Revealed by Digital Snapshot Proteomics. Mol Cell, 2018. 70(2): p. 211-227 e8.

【9】Safiulina, D., et al., Miro proteins prime mitochondria for Parkin translocation and mitophagy. EMBO J, 2019. 38(2).

【10】Berenguer-Escuder, C., et al., Impaired mitochondrial-endoplasmic reticulum interaction and mitophagy in Miro1-mutant neurons in Parkinson's disease. Hum Mol Genet, 2020. 29(8): p. 1353-1364.

【11】Celardo I, Costa AC, Lehmann S, Jones C, Wood N, Mencacci NE, Mallucci GR, Loh SH, Martins LM (2016) Mitofusin-mediated ER stress triggers neurodegeneration in pink1/parkin models of Parkinson’s disease. Cell Death Dis 7: e2271 

【12】Restelli LM, Oettinghaus B, Halliday M, Agca C, Licci M, Sironi L, Savoia C, Hench J, Tolnay M, Neutzner A et al (2018) Neuronal mitochondrial dysfunction activates the integrated stress response to induce fibroblast growth factor 21. Cell Rep 24: 1407 – 1414 

制版︱王思珍

本文完